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PCR

Polymerase chain reaction / réaction en chaîne par polymérase

Les techniques d’amplification génique sont du ressort du CNR des Brucella. La PCR et la PCR en temps réel sont apparues comme des techniques sensibles et spécifiques, particulièrement utiles dans le cas où l’administration d’une antibiothérapie empirique empêche l’isolement de Brucella. Ces techniques sont relativement rapides et exposent moins le personnel au risque de brucellose acquise en laboratoire, du fait de la manipulation de bactéries inactivées. L’amplification peut s’effectuer à partir de la colonie bactérienne, de sang total, de la couche leucocytaire ou du sérum, mais aussi dans diverses suppurations, biopsies tissulaires ou dans le LCR. A partir de sang, la sensibilité de la PCR est variable selon les études (50 à 100%) et la spécificité est comprise entre 60 et 100%. Ces variations sont classiquement dues aux différentes méthodes d’extraction, de la quantité de leucocytes, des méthodes de détection et du type de prélèvements. La présence d’inhibiteurs de l’ADN polymérase dans les échantillons cliniques peut conduire à de faux négatifs, alors que les contaminations de laboratoire ou plus rarement des réactions d’amplification croisée peuvent induire des faux positifs. Par rapport à l’hémoculture le diagnostic moléculaire de la brucellose par PCR sur échantillon de sang est moins sensible mais plus rapide (quelques heures). Il est également moins influencé par l’administration préalable d’une antibiothérapie et il limite considérablement le risque infectieux pour le personnel de laboratoire. La persistance d’une PCR positive sur sang total chez un patient traité pour brucellose pourrait être un marqueur fiable du risque de rechute de la maladie. Toutefois Vrioni et al. ont montré que 70% des patients ayant eu une brucellose traitée efficacement étaient toujours porteurs d’ADN bactérien 2 ans après l’épisode. Le suivi thérapeutique par PCR ne semble donc pas permettre d’objectiver la guérison clinique d’un patient. La détection de l’ADN de Brucella dans diverses suppurations ou biopsies tissulaires, au cours des formes focalisées de brucellose, est plus rare. Cette technique demeure plus sensible que la culture mais reste encore limitée.

Différentes techniques de biologie moléculaire permettent une identification des Brucella sp. au niveau du genre, de l’espèce et de certains biovars. Une amplification du gène codant pour l’ARN ribosomal 16S suivie d’un séquençage permet l’identification d’une bactérie du genre Brucella. Toutefois, des séquences 16S incorrectement attribuées au genre Brucella sont présentes dans la banque de données Genbank pouvant conduire à des faux positifs. La séquence d’insertion IS711 est une bonne cible fréquemment utilisée car elle est spécifique de Brucella et présente en multiples copies dans le génome augmentant ainsi la sensibilité de la détection. D’autres cibles ont été utilisées comme les gènes codant pour Bscp31, une protéine de la membrane externe de 31 kDa ou Omp2a-Omp2b et la perosamine synthétase Per.

La PCR est également utilisée pour déterminer les espèces de Brucella et certains biovars. Une PCR multiplex (Bruce-Ladder) permet ainsi l’identification de toutes les espèces isolées aussi bien chez l’homme que chez les animaux. Elle a été récemment modifiée afin d’identifier les nouvelles espèces (B. microti et B. inopinata). Enfin, l’avènement des MLSA a permis la discrimination des souches au niveau du biovar, tandis que les systèmes de typage par MLVA (séquençage répété en tandem) ou SNP sont utilisés pour identifier des clusters bactériens associés à des épidémies. Ces techniques restent encore coûteuses et longues et ne sont réalisées que par les CNR.


CNR BRUCELLA

Centre National de Référence Brucella

Service de Microbiologie
CHU de Nîmes
Place du Pr R. Debré
30029 Nîmes Cedex 9

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© 2017 - CHU de Nîmes - Tous droits réservés
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