Vous êtes ici : Accueil > Activités > Identification des espèces

Identification des espèces

  1. Examen direct

    La coloration de Gram (nécessitant de doubler ou tripler le temps de recoloration à la fuchsine) objective des coccobacilles à Gram négatif, de petite taille (0,5–1,5 mm de long ; 0,5–0,7 mm de diamètre), immobiles, isolés ou en paire, non capsulés, non sporulés.
  2. Milieux de culture

    Les Brucella spp. pathogènes pour l’homme poussent difficilement et lentement sur les milieux de culture, nécessitant des temps d’incubation prolongé (3 jours à plus de 2 semaines). La croissance de ces bactéries nécessite l’utilisation de milieux gélosés riches (gélose au sang frais, gélose au sang cuit avec facteurs de croissance), incubés à 35-37 °C, en atmosphère contenant 5% de CO2. Certaines souches (B. abortus, B. ovis) se développent mieux en atmosphère contenant 5 à 10% de CO2. La température de croissance optimale est 34°C avec un pH à 6,8.

    Les colonies sont très fines de 0,5 mm de diamètre, transparentes, légèrement bleutées, bombées à bord régulier et non hémolytiques. L’exigence en CO2 doit être déterminée sur la primoculture ou au plus tard sur le premier repiquage.

    Certaines espèces (B. microti, B. inopinata, B. suis bv5) dont la pathogénicité chez l’homme n’est pas prouvée ont une croissance rapide (colonies en 24h).
  3. Diagnostic d’espèce

    31. Caractères biochimiques

    Si le diagnostic de genre pour les Brucella est relativement aisé, le diagnostic d’espèce relève le plus souvent d’un laboratoire de référence. Toutes les souches doivent être envoyées au CNR des Brucella pour confirmation du diagnostic en respectant la législation existante pour ce micro-organisme de classe 3 (réglementation ANSM). Les souches doivent être ensuite détruites et éliminées (car elles appartiennent aux MOT, micro-organismes et toxines hautement pathogènes).

    Dans le cas d’un isolement d’une souche bactérienne, le genre Brucella peut être suspecté sur certains caractères biochimiques. Brucella spp. sont aérobies strictes et ont une catalase + (à ne réaliser que sous un PSM) et une oxydase + (sauf B. ovis et B. neotomae). Ces bactéries ne fermentent pas les sucres. La majorité des autres caractères métaboliques sont négatifs : production d’indole, réaction de Vosges-Proskauer, citrate de Simmons… En revanche, Brucella spp. ont une nitrate réductase + sauf B. ovis.

    Du fait d’une faible réactivité biochimique, l’identification de ces bactéries par les méthodes phénotypiques usuelles est difficile. L’utilisation de galeries d’identification de type API-NE (BioMérieux®) peut conduire à une fausse identification de Moraxella phenylpyruvica. De plus, elle expose le technicien à des aérosols.

    Enfin, une technique d’agglutination avec les sérums polyvalents et monospécifiques (sérum agglutinant anti-Brucella polyvalent) permettait d’orienter le diagnostic. Cette méthode, dangereuse pour le technicien du fait des risques de contamination, ne doit plus être réalisée.

    32. Classification des espèces

    L’identification d’espèce, réservée en pratique aux laboratoires spécialisés, reposait sur :

    - la lysotypie en évaluant la sensibilité à différents bactériophages (Tb, Wb, Bk…),

    - la production d’H2S, qui est variable selon les espèces,

    - l’hydrolyse de l’urée grâce à l’activité plus ou moins intense d’une uréase présente chez toutes les Brucella à l’exception de B. ovis.

    - l’étude de l’oxydation des glucides et des acides aminés et l’étude de l’action bactériostatique de la fuchsine basique et de la thionine.

    Ces techniques sont maintenant abandonnées au profit des outils de biologie moléculaire.

    Un test commercial (Taxa Profile®) simple de biotypage évaluant le métabolisme des différentes espèces de Brucella à 191 substrats a été développé et semble prometteur.

    33. Diagnostic génomique

    Les techniques d’amplification génique sont du ressort du CNR des Brucella. La PCR et la PCR en temps réel sont apparues comme des techniques sensibles et spécifiques, particulièrement utiles dans le cas où l’administration d’une antibiothérapie empirique empêche l’isolement de Brucella. Ces techniques sont relativement rapides et exposent moins le personnel au risque de brucellose acquise en laboratoire, du fait de la manipulation de bactéries inactivées. L’amplification peut s’effectuer à partir de la colonie bactérienne, de sang total, de la couche leucocytaire ou du sérum, mais aussi dans diverses suppurations, biopsies tissulaires ou dans le LCR. A partir de sang, la sensibilité de la PCR est variable selon les études (50 à 100%) et la spécificité est comprise entre 60 et 100%. Ces variations sont classiquement dues aux différentes méthodes d’extraction, de la quantité de leucocytes, des méthodes de détection et du type de prélèvements. La présence d’inhibiteurs de l’ADN polymérase dans les échantillons cliniques peut conduire à de faux négatifs, alors que les contaminations de laboratoire ou plus rarement des réactions d’amplification croisée peuvent induire des faux positifs. Par rapport à l’hémoculture le diagnostic moléculaire de la brucellose par PCR sur échantillon de sang est moins sensible mais plus rapide (quelques heures). Il est également moins influencé par l’administration préalable d’une antibiothérapie et il limite considérablement le risque infectieux pour le personnel de laboratoire. La persistance d’une PCR positive sur sang total chez un patient traité pour brucellose pourrait être un marqueur fiable du risque de rechute de la maladie. Toutefois Vrioni et al. ont montré que 70% des patients ayant eu une brucellose traitée efficacement étaient toujours porteurs d’ADN bactérien 2 ans après l’épisode. Le suivi thérapeutique par PCR ne semble donc pas permettre d’objectiver la guérison clinique d’un patient. La détection de l’ADN de Brucella dans diverses suppurations ou biopsies tissulaires, au cours des formes focalisées de brucellose, est plus rare. Cette technique demeure plus sensible que la culture mais reste encore limitée.

    Différentes techniques de biologie moléculaire permettent une identification des Brucella sp. au niveau du genre, de l’espèce et de certains biovars. Une amplification du gène codant pour l’ARN ribosomal 16S suivie d’un séquençage permet l’identification d’une bactérie du genre Brucella. Toutefois, des séquences 16S incorrectement attribuées au genre Brucella sont présentes dans la banque de données Genbank pouvant conduire à des faux positifs. La séquence d’insertion IS711 est une bonne cible fréquemment utilisée car elle est spécifique de Brucella et présente en multiples copies dans le génome augmentant ainsi la sensibilité de la détection. D’autres cibles ont été utilisées comme les gènes codant pour Bscp31, une protéine de la membrane externe de 31 kDa ou Omp2a-Omp2b et la perosamine synthétase Per.

    La PCR est également utilisée pour déterminer les espèces de Brucella et certains biovars. Une PCR multiplex (Bruce-Ladder) permet ainsi l’identification de toutes les espèces isolées aussi bien chez l’homme que chez les animaux. Elle a été récemment modifiée afin d’identifier les nouvelles espèces (B. microti et B. inopinata). Enfin, l’avènement des MLSA a permis la discrimination des souches au niveau du biovar, tandis que les systèmes de typage par MLVA (séquençage répété en tandem) ou SNP sont utilisés pour identifier des clusters bactériens associés à des épidémies. Ces techniques restent encore coûteuses et longues et ne sont réalisées que par les CNR.
  4. Diagnostic protéique

    La spectrométrie de masse (MALDI-TOF) est une technologie en pleine expansion en microbiologie du fait de sa rapidité, de sa précision et de son faible coût. Devant l’absence de base de données en IVD et le manque de sécurité lors du dépôt de la colonie bactérienne sur la lame, plusieurs épisodes de contamination du personnel des laboratoires ont été observés.

    Devant tout coccobacille à Gram négatif issu d’hémocultures, il est donc essentiel de prendre des précautions. Une technique simple, rapide et fiable a été récemment développée pour éviter toute contamination du personnel (en savoir plus).

  5. Etude de la sensibilité aux antibiotiques

    Actuellement la détermination de la sensibilité de Brucella spp. aux antibiotiques n’est pas indispensable et n’est pas recommandée. Les souches sont très majoritairement sensibles aux antibiotiques couramment prescrits contre cette infection et il y a un fort risque de contamination du personnel de laboratoire lors de cette manipulation. Il est donc formellement contre-indiqué d’effectuer cette recherche. De plus, il n’existe pas de méthode standardisée de détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) pour ce genre bactérien. Seule la souche vaccinale RB51 est résistante à la rifampicine mais elle n’est que très peu présente en Europe. Si un antibiogramme est tout de même réalisé, il doit être exclusivement réalisé par le CNR Brucella devant un cas particulier.

    Classiquement les antibiotiques les plus actifs sont les aminosides (streptomycine, gentamicine), la rifampicine, les tétracyclines et les fluoroquinolones. Les aminosides et la rifampicine ont une activité bactéricide. Les céphalosporines de 3ème génération et l’imipénème sont également très actifs in vitro mais n’ont pas d’intérêt clinique dans cette pathologie. L’activité du cotrimoxazole varie en fonction des souches, les macrolides et le chloramphénicol sont peu actifs.

    Les résistances acquises aux antibiotiques chez Brucella sont exceptionnelles et de mécanismes mal connus. Des mutants résistants à la rifampicine ont été générés in vitro. En clinique, une surveillance de la sensibilité aux antibiotiques des Brucella est réalisée dans les laboratoires de référence pour veiller à l’efficacité des traitements recommandés au cours des brucelloses. C’est ainsi que des niveaux élevés de résistance au cotrimoxazole et à la ciprofloxacine ont été notés en Arabie Saoudite. Ces observations restent toutefois exceptionnelles.

CNR BRUCELLA

Centre National de Référence Brucella

Service de Microbiologie
CHU de Nîmes
Place du Pr R. Debré
30029 Nîmes Cedex 9

CNR BRUCELLA
Centre National de Référence Brucella

Service de Microbiologie
CHU de Nîmes
Place du Pr R. Debré
30029 Nîmes Cedex 9

© 2017 - CHU de Nîmes - Tous droits réservés
Centre National de Référence BRUCELLA - CHU de Nîmes - Place du Pr R. Debré - 30029 Nîmes Cedex 9 | © 2017 - CHU de Nîmes - Tous droits réservés